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    實(shí)驗(yàn)方式大起底

    發(fā)布時(shí)間: 2017-03-27  點(diǎn)擊次數(shù): 1181次

    ELISA試劑盒大起底
    從樣品中分離提純同種試劑盒,是許多下游應(yīng)用的關(guān)鍵一步,分離得到的細(xì)胞可以用于基因鑒定、大鼠小鼠ELISA試劑盒計(jì)數(shù)、生化分析、蛋白分離、宿主-病原體互作以及細(xì)胞間相互作用等研究。
    一款合適的分離試劑盒可以說(shuō)是實(shí)驗(yàn)成功的保障,因?yàn)橹挥蝎@得正確的ELISA試劑盒,下游的分析結(jié)果才可能準(zhǔn)確。目前,市面上有多種多樣的分離試劑盒可供選擇,它們的主要區(qū)別在于分離方法和篩選標(biāo)志。那么,如何選擇自己的細(xì)胞分離試劑盒呢?希望本文能為你提供一些幫助。
    正向選擇VS負(fù)向選擇
    試劑盒分離試劑盒的工作原理主要有兩種,正向選擇和負(fù)向選擇。正向選擇的試劑盒直接結(jié)合的抗體來(lái)進(jìn)行捕獲。這種抗體通常與磁珠相連,可以利用磁鐵將懸液中的抗體-磁珠-復(fù)合物提取出來(lái),再通過(guò)二抗將磁珠與目標(biāo)分開(kāi)。負(fù)向選擇的試劑盒也采用類似的抗體包被磁珠,不過(guò)這種試劑盒是通過(guò)去除樣品中的非目的,來(lái)間接捕獲目的。
    這兩種細(xì)胞分離試劑盒如何取舍,主要取決于目標(biāo)細(xì)胞的表面是否具有特異性強(qiáng)的篩選標(biāo)志。這樣的篩選標(biāo)志能夠?qū)崿F(xiàn)特異性的捕獲,避免所獲得的細(xì)胞被非目標(biāo)細(xì)胞污染。如果你的目標(biāo)細(xì)胞剛好具有這樣的篩選標(biāo)志,那么正向選擇的細(xì)胞分離試劑盒就是*選擇。但如果目標(biāo)細(xì)胞并不具有特異性強(qiáng)的篩選標(biāo)志,那我們還是選用負(fù)向選擇的細(xì)胞分離試劑盒。
    篩選標(biāo)志的確定
    通過(guò)PubMed等數(shù)據(jù)庫(kù)中的文獻(xiàn),我們一般可以確定在目標(biāo)上表達(dá)的篩選標(biāo)志。如果文獻(xiàn)中找不到適合自己的表面標(biāo)志,我們還可以用目標(biāo)的DNA序列進(jìn)行BLAST搜索。BLAST搜索結(jié)果會(huì)顯示,目標(biāo)細(xì)胞上可能表達(dá)的表面標(biāo)志,在此基礎(chǔ)上可以選取用于捕獲的細(xì)胞表面蛋白。舉例來(lái)說(shuō),對(duì)一個(gè)T進(jìn)行BLAST搜索,結(jié)果會(huì)顯示該是否表達(dá)CD4或CD8。在得知目標(biāo)表達(dá)CD4之后,我們可以先對(duì)樣品進(jìn)行一個(gè)免疫實(shí)驗(yàn)(如ELISA),以檢驗(yàn)BLAST搜索的結(jié)果。一旦證實(shí)目標(biāo)的確表達(dá)CD4,我們就可以用相應(yīng)試劑盒來(lái)篩選CD4陽(yáng)性的T細(xì)胞。
    一般流程
    對(duì)于一個(gè)旨在分離CD4陽(yáng)性T的試劑盒來(lái)說(shuō)小鼠ELISA試劑盒,操作流程主要有以下幾步。首先,將樣品與anti-CD4抗體包被的磁珠共同孵育,使抗體與CD4+ T結(jié)合。然后洗去不需要的非目標(biāo)(即不表達(dá)CD4的),留下磁珠-抗體-復(fù)合物。ELISA試劑盒將上述復(fù)合物與能結(jié)合anti-CD4抗體的二抗一起孵育胞,形成磁珠-抗體-二抗復(fù)合物。我們可以用磁鐵去除這種磁珠-抗體-二抗復(fù)合物,而所有的CD4+細(xì)胞留在上清中。zui后,只需將上清轉(zhuǎn)移就可以進(jìn)行下游研究了。

     

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