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    用噬菌體上清和人血清進行ELISA

    發(fā)布時間: 2011-10-18  點擊次數(shù): 1370次

    用噬菌體上清和人血清進行ELISA[
    器材和試劑]
    ● 多孔板 (Immuno plate Maxisorp, Nuric)
    ● 包被緩沖液 (50mmol/L NaHC03, pH 9.6,0.05%硫柳汞)
    ● 單克隆抗體(mAb)57D1。該抗體 能識別M13噬菌體次要衣殼蛋白(pⅢ)的N末端。它是用M13噬菌體 顆粒免疫大鼠而獲得的。來自含57D1 雜交瘤細胞的上清用 50% (NH4)2SO4沉淀,然后在PBS中溶 解并透析,zui后抗體在蛋白G—Sepha— rose上免疫純化。
    ● PBST
    ● 封閉液(PBS,5%脫脂牛奶,0.05% Tween—20,0.02%硫柳汞)
    ● 噬菌體上清
    ● 細菌提取物
    ● PEG—濃縮的nRl—11.1噬菌體
    ● 來自無關(guān)的大鼠雜交瘤細胞上清
    ● AP標記的羊抗人IgG Fc—特異性抗體 (Sigma),用封閉液按1:5000比例稀釋
    ● 底物緩沖液(10%二乙醇胺,0.5mmol/ LMgCl2,0.05%NaN3,用HCl調(diào)節(jié)到 pH 9.8)
    ● 顯色液(1mg/ml p—硝基苯磷酸的底物 緩沖液)
    ● 自動酶標儀

    [方法]
    1.將200ul濃度為1ug/ml的抗pⅢmAb 57D1①包被緩沖液,分別加在多孔板各個板孔 中。4℃孵育過夜。
    2.棄去包被液,并用PBST洗滌數(shù)次。
    3.每孔加250ul封閉液,37℃孵育60分鐘。包被板可立即使用或在一20℃保存數(shù)周。
    4.每孔加100ul封閉液和100ul如上述制備的清亮噬菌體上清。在37℃下孵育60分鐘以 使噬菌體顆粒結(jié)合。
    5.將人血清在200ul封閉液中,室溫預(yù)孵育30分鐘;其中包含2.5ul細菌提取物、大約 5 × 1010pfuPEG—濃縮f1Rl—11.1噬菌體以及10ul來自無關(guān)大鼠雜交瘤細胞上清。當(dāng) 檢測單個克隆時,采用1:100比例稀釋血清; 當(dāng)檢測噬菌體文庫時,采用1:400比 例稀釋血清。此步可以減少針對野生型噬菌體的血清抗體、細菌污染物及大鼠抗pⅢ單 抗的干擾。
    6.從包被板中棄去噬茵體上清,并用PBST充分洗滌板孔。
    7.在每孔中加200ul預(yù)孵育的血清混合物,在室溫下孵育2小時。
    8.除去血清混合物,用PBST充分洗滌板孔。在每孔中加入200ul堿性磷酸酶標記二抗, 室溫孵育60分鐘。
    9.除去二抗溶液,并用PBST充分洗滌。用底物緩沖液快速洗滌板孔。
    10.在每孔中加200ul顯色液,37℃暗處孵育15—60分鐘。
    11.用自動酶標儀將A405和A655間的差值作為結(jié)果記錄。
     

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