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    彗星電泳法檢測細(xì)胞損傷試劑盒

    發(fā)布時間: 2013-08-15  點(diǎn)擊次數(shù): 907次

    彗星電泳法檢測細(xì)胞損傷ELISA試劑盒
    彗星法 DNA 損傷檢測試劑盒
    ( Comet Assay for DNA Damage Detection Kit)
    Cat number:KGA For Research Use Only
    Store at4℃ for one year
    Expire date:
    一、試劑盒說明
    DNA在自由基(如·OH)的攻擊下容易發(fā)生損傷,即脫氧戊糖遭到破壞,磷酸二脂鍵的斷裂,堿基的破壞或脫落,便可進(jìn)一步產(chǎn)生單鏈斷裂或雙鏈斷裂。將細(xì)胞固定于低熔點(diǎn)瓊脂糖中,取少量細(xì)胞涂在載玻片上,用堿高鹽溶液破壞細(xì)胞膜,再用堿溶液使DNA分子解旋。將載玻片置于電泳液中,在電場的作用下,DNA分子向陽極移動。如果DNA損傷嚴(yán)重,碎片多,則電泳速度快。未受損傷的DNA大分子則由于細(xì)胞膜的阻隔,滯留在原處。用PI染色或銀染,可觀察到DNA受損的細(xì)胞形同彗星現(xiàn)象,作定性分析。也可用相關(guān)的軟件作定量分析。
    二、試劑盒組份
    組份
    Cat: KGA240(20 assays)
    儲存條件
    Lysis Bufffer
    100 mL
    4℃
    DMSO
    8 mL
    4℃
    正常熔點(diǎn)瓊脂糖NMA
    30 mg
    4℃
    低溶點(diǎn)瓊脂糖LMA
    30 mg
    4℃
    Propidium Iodide (PI)
    400μL
    4℃避光
    三、 Kit以外自備儀器和試劑
    低速離心機(jī) 、水平電泳儀、熒光顯微鏡、370C、450C水浴、載玻片、蓋玻片、平皿、微量移液器、1.5m L Microtube、0.4mmol/LTris-HCl(pH7.5)緩沖液、PBS
    四、注意事項(xiàng)
    Propidium Iodide (PI)和EB有毒,操作時要戴手套。
    五、操作方法
    1.細(xì)胞用冰冷的PBS洗一次,離心收集,用PBS重懸使其密度為1×106個/mL;
    2.鋪膠: 下述各濃度瓊脂糖凝膠均用PBS配制
    第1層凝膠的制備::將載玻片的磨砂面向上,40℃預(yù)熱,將預(yù)熱45℃的100μL的0.5%正常熔點(diǎn)瓊脂糖(NMA)鋪于載玻片上,蓋上干凈的蓋玻片,再置4℃下10min使NMA凝固。
    第2層凝膠的制備::將10μL細(xì)胞(約 104個)和75μL的0.7%低溶點(diǎn)瓊脂糖LMA(在37℃下水浴加熱至少20min使之*溶化)混合均勻。然后,輕輕揭去蓋玻片,ELISA試劑盒迅速將含細(xì)胞的LMA滴到第1層瓊脂糖上,立即蓋上另一干凈蓋玻片,置4℃10min使第2層LMA凝固。
    第3層凝膠的鋪制::第2層LMA凝固后,在室溫下小心移去蓋玻片,滴加預(yù)熱37℃的75μL的0.7%低溶點(diǎn)瓊脂糖LMA,如上蓋上蓋玻片4℃下凝固(第三層覆蓋第二層周圍0.5mm,增加凝膠化作用時間至30min,高濕度環(huán)境)。
    3.細(xì)胞裂解 移去蓋玻片,將玻片置于平皿中,倒入預(yù)冷的Lysis Bufffer (使用前每9 mL加入1 mL的DMSO), 4℃裂解1~2h,取出載玻片用PBS漂洗。
    4.DNA堿解旋 將載玻片置于水平電泳槽。倒入新配制的堿性電泳緩沖液(用戶自備1mmol/L EDTA,300mmol/L NaOH),約覆過載玻片膠面0.25cm左右,室溫放置20~60min,以便使DNA在堿性條件下解螺旋和產(chǎn)生堿易變性區(qū)段,使DNA斷鏈在電場中易于遷移。
    5.單細(xì)胞電泳 在電壓25V,電泳20~30min,電壓、電流可用改變緩沖液面高低來調(diào)節(jié)。
    6.中和與染色 電泳后將載玻片置于平皿內(nèi)。加入0.4mmol/LTris-HCl(pH7.5)緩沖液,將載玻片沒入,4℃中和三次,每次10min,棄去Tris-HCl緩沖液,每載玻片加20μL的PI染液或EB染液,蓋上蓋玻片,避光染色10min。
    7.觀察、拍照和分析 熒光顯微鏡515~560nm波長的激發(fā)光、PI染色的DNA圖象呈紅色,EB染色的DNA圖象呈桔紅色,可清楚地觀察到核DNA和遷移的DNA(即慧星尾)。每個樣本隨機(jī)選擇100個細(xì)胞,測定核DNA直徑和DNA遷移的長度,可并用相應(yīng)的軟件分析。DNA損傷按彗星尾部DNA量占全部DNA量的比例分為5級: 0級: < 5% 無損傷;ELISA試劑盒 1級 5~20% 輕度損傷;2級 20~40% 中度損傷;3級 40~95% 高度損傷;4級 >95% 重度損傷

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